A novel experimental platform for monitoring and imaging bacterial biofilm growth in porous media flows

Abstract

Biofilms are complex microbial communities that primarily grow on solid surfaces where micro-organisms are embedded in extracellular polymeric substances (EPS). This lifestyle is dominant over the planktonic phenotype and is found in various environments such as the suboceanic subsurface and soils. The growth of biofilms in porous media under flow conditions is widespread in natural and man-made systems, and they play a crucial role in Earth’s critical :,one, driving ecosystem processes and contributing to biogeochemical cycles.

Moreover, biofilms are also used to engineer the properties of porous systems such as hydraulic conductivity, chemical speciation, or physic-chemical properties of multiphase systems. Examples of such systems include biological filters, submerged bed and trickling filters, co-current systems that filter suspended matter, ammonia, phosphorus, and micro-pollutants from wastewater, bio-barriers or bioremediation processes, microbially-enhanced oil recovery, self-healing concrete, and sealing cap rock fractures in CO₂ aquifer storage.

Biofilm formation initiates with the attachment of microorganisms onto surfaces under appropriate flow and nutrient conditions. Porous media with high surface-to-volume ratios provide an ideal envi- ronment and substrate for studying biofilm growth. Various natural systems in the environment (such as rocks, soil, sand) and our bodies (such as lungs, bones) can be considered as porous media.

However, understanding the mechanisms that control biofilm development in porous media is chal- lenging due to the structural complexity and the opacity of the 3D porous structure. Several factors control biofilm growth, such as nutrient/oxygen availability, flow rate, communication, and shear stress. lmproved quantification of the physical aspects of biofilm growth is essential in unraveling the mechanisms of biofilm formation in porous materials and progressing towards new biotechnologies.

To gain insight into how fluid flow, transport phenomena, and biofilms interact within heterogeneous structures, a versatile, micro-scale, 3D-printed micro-bioreactor has been devised. The bioreactor allows for the precise measurement of several parameters of such systems, enabling controlled and reproducible studies of biofilms in 3D porous systems. The approach to 3D imaging of biofilms in such systems uses X-ray micro-tomography with functionali:,ed gold nanoparticles as a contrast agent. Preliminary results of P. aeruginosa biofilm development in this system suggest that biofilm growth in porous media under flow is a dynamic process resulting from an equilibrium between competing mechanisms such as bacterial growth and detachment due to hydrodynamic stresses.

The experimental setup, with the 3D-printed micro-bioreactor being in the heart of it, provides an adjustable, versatile experimental workbench for the study of the growth and detachment dynamics of biofilms in porous media under controlled conditions over long periods of time. The combination with X-ray tomography imaging provides insight into how physical (flow rate, shear stress) and chem- ical (oxygen, nutrient availability) parameters of the system affect the biofilm’s spatial distribution. Understanding biofilm growth dynamics in the mesoscale could potentially unlock novel biotechnolo- gies. Therefore, the main objective of this work is to develop a methodology to study biofilm growth dynamics in porous systems under flow in a precise and controlled manner, utili:,ing a 3D-printed micro-bioreactor and X-ray micro-tomography imaging. Furthermore, CFD simulations are used in combination to the obtained X-ray tomography images to have an insight of the biomass distribution within a porous structure. Finally, in this work, the potential of novel contrast agents based on gold nanoparticles will be examined and their suitability as a contrast agent will be assessed.

Résumé

Les biofilms sont des communautés microbiennes complexes qui se développent principalement sur des surfaces solides où les micro-organismes sont intégrés dans des substances polymériques extracellulaires (EPS). Ce mode de vie est dominant par rapport au phénotype planctonique et se retrouve dans divers environnements tels que la subsurface des océans et les sols. La croissance de biofilms dans des milieux poreux dans des conditions d’écoulement est très répandue dans les systèmes naturels et artificiels, et ils jouent un rôle crucial dans la :,one critique de la terre, en pilotant les processus écosystémiques et en contribuant aux cycles biogéochimiques.

En outre, les biofilms sont également utilisés pour modifier les propriétés des systèmes poreux, telles que la conductivité hydraulique, la spéciation chimique ou les propriétés physico-chimiques des sys- tèmes multiphasiques. Parmi ces systèmes, on peut citer les filtres biologiques, les filtres à lit immergé et à ruissellement, les systèmes à co-courant qui filtrent les matières en suspension, l’ammoniac, le phosphore et les micropolluants des eaux usées, les barrières biologiques ou les processus de biorestau- ration, la récupération du pétrole améliorée par les microbes, le béton auto-cicatrisant et le colmatage des fractures de la roche de couverture dans le stockage aquifère du CO₂.

La formation d’un biofilm commence par la fixation de micro-organismes sur des surfaces dans des conditions d’écoulement et de nutriments appropriées. Les milieux poreux présentant un rapport surface-volume élevé constituent un environnement et un substrat idéaux pour l’étude de la croissance des biofilms. Divers systèmes naturels dans l’environnement (tels que les roches, le sol, le sable) et notre corps (tels que les poumons, les os) peuvent être considérés comme des milieux poreux.

Cependant, comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement des biofilms dans les mi- lieux poreux est un défi en raison de la complexité structurelle et de l’opacité de la structure poreuse en 3D. Plusieurs facteurs contrôlent la croissance du biofilm, tels que la disponibilité des nutriments et de l’oxygène, l’écoulement, la communication et le cisaillement. Une meilleure quantification des aspects physiques de la croissance des biofilms est essentielle pour élucider les mécanismes de formation des biofilms dans les matériaux poreux et progresser vers de nouvelles biotechnologies.

Pour mieux comprendre comment l’écoulement des fluides, les phénomènes de transport et les biofilms interagissent au sein de structures hétérogènes, un micro-bioréacteur polyvalent, à micro- échelle et imprimé en 3D a été conçu. Le bioréacteur permet de mesurer avec précision plusieurs paramètres de ces systèmes, ce qui permet des études contrôlées et reproductibles des biofilms dans les systèmes poreux en 3D. L’approche de l’imagerie 3D des biofilms dans ces systèmes utilise la micro- tomographie à rayons X avec des nanoparticules d’or fonctionnalisées comme agent de contraste. Les résultats préliminaires du développement du biofilm de P. aeruginosa dans ce système suggèrent que la croissance du biofilm dans les milieux poreux soumis à un écoulement est un processus dynamique résultant d’un équilibre entre des mécanismes concurrents tels que la croissance bactérienne et le détachement dû aux contraintes hydrodynamiques.

Le dispositif expérimental, au cœur duquel se trouve le micro-bioréacteur imprimé en 3D, constitue un banc d’essai réglable et polyvalent pour l’étude de la dynamique de croissance et de détachement des biofilms dans les milieux poreux, dans des conditions contrôlées et sur de longues périodes de temps. La combinaison avec l’imagerie par tomographie à rayons X permet de comprendre comment les paramètres physiques (débit, contrainte de cisaillement) et chimiques (oxygène, disponibilité des nutriments) du système affectent la distribution spatiale du biofilm. La compréhension de la dy- namique de croissance des biofilms à l’échelle méso pourrait potentiellement débloquer de nouvelles biotechnologies. Par conséquent, l’objectif principal de ce travail est de développer une méthodologie pour étudier la dynamique de croissance des biofilms dans les systèmes poreux sous écoulement de manière précise et contrôlée, en utilisant un micro-bioréacteur imprimé en 3D et l’imagerie par micro- tomographie à rayons X. En outre, les simulations CFD sont utilisées en combinaison avec les images de tomographie à rayons X obtenues pour avoir un aperçu de la distribution de la biomasse au sein d’une structure poreuse. Enfin, dans ce travail, le potentiel de nouveaux agents de contraste basés sur des nanoparticules d’or sera examiné et leur pertinence en tant qu’agent de contraste sera évaluée.